defgf67ay
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 Wysłany: Wto 12:04, 01 Mar 2011 Temat postu: oakley brillen 番木瓜Ĩ |
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番木瓜环斑病毒检测技术的研究
提取液的紫外吸收光谱max为280am，Amin为250nm,[link widoczny dla zalogowanych]，是典型的蛋白吸收光谱。IgG的工作浓度根据本研究制定的操作程序，以1pIPRV-Ys株系的粗提纯物点样NCM，IgG溶液以l／10‘稀释后得到的结果(图版Ⅵ1)表明，当IgG溶液稀释到1t100时，NCM上的棕黄色阳性斑仍比较清晰，放以lt100的稀释度作为本研究IgG的工作浓度。此时IgG溶液浓度为2．2#g／ml。2．cDNA分子探针的合成第2期臻枝楠等：葺术瓜环斑病毒捡衡技术的研究167PRV的纯化：PRVl四个株系粗制剂浓度分别为22．2，14．2，9．4和19．4ag／mI。其中PRV—Ys的精提纯制剂(图版Ⅵ2)病毒浓度为0．2219mg／m]。其OD260／OD280值为1．25。PRV—RNA的提取：PRV四个株系RNA溶液浓度分别为81．04，72．10，69．20和21．52,ug／mI。其中PRV—YsRNA溶液紫外光谱曲线Amax是260nm,Amin是236nm，OD260／OD280值约为2。cDINA分子探针的合成：sscDNA和dscDNA合成效果分别为17．0和14．0％。dscD／~A放射自显影见图版Ⅵ3。45个细菌克隆原位分子杂交结果见图版Ⅵ4。阴性对照点样斑没有任何影像，而其它点样点则有不同强度的放射自显影影像。pYs6重组质粒经EcoRI／PstI双酶切后，其电泳图谱(图版Ⅵ5)显示插入的cDN段约为300bp。3．灵敏度测定间接Dot—ELISA检测灵敏度：PRV四个株系点样NcM的显色反应见图版Ⅶ6。其最低可检测量分别为每点样斑22．2,[link widoczny dla zalogowanych]，14．2,[link widoczny dla zalogowanych]，9．4和19．4ng。裹1eDNA分手撵针觅簟虞幢潮T目ble1Teit0fcDNAmolⅧ1日P0bⅡitiTity讨论cDNA分子探针的检测灵敏度PRV四个株系点杂交结果见表1，其最低可检测PRV—RNA量分别为每点样斑36．46，32．00，21．52}口32．2BPg。根据Smith和Banttari(1984)等“““”检测马铃薯卷叶病毒(PLRV)的Dot—ELISA(用微板作支持物)的原理，本研究选择以3酪蛋白作封闭剂，SPA—HRP作酶标结合物，成功地建立了检测PRV的间接Dot—ELISA。检测PRV四个株系的灵敏度都达到了ng水平，说明是较理想的PRV病毒粒子的检测方法,[link widoczny dla zalogowanych]。这个方法[；LGonsa—lves(1984)等“”用的常规ELISA不仅在检测灵敏度上提高近十倍，而且还由于是在1NCM上直接点样，因而操作过程更为快速、简便，观察结果直观。另外整个过程只需2—3小时内在37℃恒温下即可完成，比Smith和Banttari等检测其它病毒时在室温下进行既稳定又缩短了3—4小时-，“。然而，由于本研究使用的兔抗血清滴度不高，致使IgG工作浓度偏高,[link widoczny dla zalogowanych]。由于PRV—RNA3末端具有poly(A)结构，而且病毒的外壳蛋白编码基因又靠近3末端“”…，因而在合成sscDNA时选用了oligo(dT)。作引物，这样就有可能获得具有专化性较强的3末端基因片段。本研究最终筛选的一个编号为pYs6的克隆，其PRV—RNAeDNA基因片段约为30obp，符合作为分子探针最好是存250—1250bp大小范围的要求¨圳。当刷一”P标记pYs6cDNA时，检测PRV4个株系RNA的灵敏度都在pg水平，说明是较满意的检测PRV—RNA的分子探针。这不仅比本研究．所建立168中国病毒学第8卷的间接Dot—ELISA更为灵敏，准确，而且还比Gonsalves等…“‘用的常规ELISA提高灵敏度近千倍
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